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    問題解答

    膠原酶消化組織(細胞)類型?

    膠原酶IV型:建議用于胰腺中的胰島細胞消化

    膠原酶II型:建議用于骨,心,肝,甲狀腺和涎腺細胞原代分離

    膠原酶I型:建議用于上皮,肝,肺和腎上腺皮質細胞原代分離

    抗熒光衰減封片劑固定不???

    封片劑分兩種:流動的和凝固的;美侖封片劑(MA0236/ MA0235/ MA0222/ MA0221)是甘油的,也就是流動型的,故此不是凝固型,如果擔心移動,可在蓋玻片周圍用指甲油密封,并置于4℃或者-20℃避光保存;儲存不能豎立,最好平放。

    怎么確定買哪條通路的抑制劑?

    首先:每條通路的靶點有很多,其次:這個抑制劑不一定作用您選的靶點,最好是您找到相應想做的靶基因,針對性挑選這個靶基因所對應的抑制劑或者激活劑,后續需要用蛋白水平和RNA水平驗證,最好有文獻支撐。

    GoldView I 和SYBR Green I

    GoldView I(MB0078)是一種可代替溴化乙錠(EB)的新型核酸染料。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA時,GoldView I與核酸結合后能產生很強的熒光信號,其靈敏度與EB相當,使用方法與之完全相同。
    GoldView I是一種熒光色素,激發濾光片波長488nm,阻斷濾光片波長515nm。GoldView I不僅能染DNA,也可用于染RNA,GoldView I與細胞中DNA和RNA結合量存在差別,可發出不同顏色的熒光(即著色特異性),這是由于DNA是個高度聚合物,吸收熒光物質的位置較少,發綠色熒光,而RNA聚合度低,能和熒光物質結合的位置多,故發紅色熒光。
    通過小鼠皮下注射實驗,尚未發現GoldView有致癌作用,而溴化乙錠(EB)是一種強致癌劑,因此用GoldView代替EB不失為一種明智的選擇。

    區別:GoldView I特別適合于大片段DNA的檢測(大于1kb的片段,檢測靈敏度與EB相當);當DNA片段小于1kb時,檢測靈敏度低于EB,特別是低于500bp的片段,GoldView I型可能亮度很弱或檢測不到。如果檢測小片段的DNA,請選用GoldView Ⅱ(MB0077)型核酸染色劑,該染色劑適合于檢測所有片段大小的DNA片段。

    SYBR Green(MB3387)是高靈敏的DNA熒光染料。適用于各種電泳分析,操作簡單,無須脫色或沖洗。至少可檢出20 pg DNA,高于EB染色法25~100倍。與dsDNA 結合熒光信號會增強800~1000倍。用核苷酸膠體染料染色的凝膠樣品熒光信號強,背景信號低??蛇m用于多種電泳分析:瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳、脈沖電場凝膠電泳和毛細管電泳等。核苷酸膠體染料與雙鏈DNA的親和力非常高,因此可用作電泳前染色,對分子生物學中常用的酶(如Taq酶、逆轉錄酶、內切酶、T4連接酶等)沒有抑制作用,另外核苷酸膠體染料與EB相比,誘變能力大大降低。

    PHA-M和PHA-L有區別?

    PHA-L是純化的L4,主要功能就是作為T淋巴細胞的刺激原,廣泛用于免疫學研究(如作為INF-γ ICS、ELISPOT實驗的陽性對照;或作為PBMC培養的刺激物),也可以作為順行神經示蹤劑;PHA-M是植物血凝素的粘性蛋白形式,兩者成分相當,主要用于刺激外周單個核細胞增殖,促進某些細胞因子的產生和膜表面蛋白的表達。

    固定液有晶體析出

    美侖固定液MA0192,有晶體析出不影響,可以室溫或15-20℃水浴溶解之后使用。

    染色實驗染的很少,熒光很低

    說明書給的條件是通用條件,可以跟據自己實際實驗情況調整,例如:工作液濃度,染色時間,孵育條件。

    核磁峰不對?

    有些產品檢測如果用DMSO作為溶劑的話,DMSO溶劑峰的位置可能會跟試劑中H的位置有重疊,積分出來可能會少H。DMSO溶劑的峰比較大,可能蓋住了試劑里的H。

    標準品做的液相圖譜不太好?出的峰不確定是不是樣品峰?

    液相條件不一樣,結果是不一樣的,標準品可以按照對應批次的美侖液相條件檢測;確認是否為樣本峰,做個溶劑對照一下,如果溶劑沒有那個峰,而樣品有峰,那就是了。

    支原體預防和清除試劑有什么區別?

    美侖支原體預防劑(MA0339)可以用于防止支原體污染;支原體清除劑(MA0340)可以用于消除細胞中已有的支原體污染,加入支原體清除試劑,細胞會長得稍慢點,但能長;如若支原體清除后,可以換成預防試劑長期使用,清除試劑不建議長期用。

    雙酶檢測試劑盒常見問題

    1酶標儀檢測,酶標儀的設置條件是什么?

    需要選擇化學發光模式

    2.雙酶檢測范圍

    雙酶是在轉錄水平上的檢測

    3.轉染是瞬轉還是穩轉?

    美侖對應檢測的是瞬轉的

    4)可以用于植物么?

    閃光型(MA0517),只要細胞充分破碎,都可以用;因為是先提蛋白,再檢測,所以可以用于植物;輝光型(MA0519),原位裂解肯定破碎不充分,所以才針對哺乳動物細胞使用,植物最好不用,第一可能裂解不充分,第二沒有數據支撐。

    Cy5跟Cy5-NH酯有什么區別?

    Cy5是一種用于標記肽, 蛋白質, 寡核苷酸的氨基基團的反應染料。 激發波長 (nm): 648, 發射波長 (nm): 662. Cy5-NH酯更廣泛應用于多肽,蛋白,核苷酸等,還能用于納米材料等;EX激發波長 646 nm EM發射波長 664nm;Cy5一般是用水溶解的,如果是易降解的蛋白質,當使用DMF或DMSO是不可取的,需要用Cy5-NH酯,如需要氨基反應探針可選擇Cy5-NH酯,Cy5-NH也可以用水溶。

    購買美侖復蘇好的細胞,注意事項

    收到細胞后, 顯微鏡下觀察細胞形態是否正常,對于貼壁細胞則要注意看貼壁情況是否良好,觀察細胞密度,確認細 胞無異常, 用 75%酒精對培養瓶表面進行消毒處理,將培養瓶置于細胞培養箱中靜置培養 3-4 小時,以恢復細胞 狀態,如果細胞密度不高,建議過夜培養。若細胞密度超過 80%,則可以根據以下提供的傳代步驟進行傳代;若細胞密度未達到 80%,則先吸除 原來培養瓶中大部分的培養基,留下 5-10ml 左右,稍微擰松瓶蓋,繼續放入細胞培養箱中培養,直到細 胞密度超過 80%時再進行傳代。中途如覺得細胞長的較緩慢,可向培養瓶中添加5%的血清。

    酵母培養基和酵母粉區別?

    酵母培養基是一大類,包括YPD培養基,有些是用酵母粉配置的;具體配置哪種酵母培養基,可以找下對應配方。

    SOSG單線態氧熒光探針常見問題

    1單線態氧就是活性氧嗎?

    單線態氧屬于活性氧,是普通氧的激發態。單線態氧雖不是自由基,但因解除了自旋限制所以反應活性遠比普通氧高。

    2SOSG甲醛溶液滴入水溶液中,會有熒光強度么?

    SOSG甲醛溶液滴入水溶液中會有熒光強度的,水也是有單態氧的,有的話就有熒光強度。

    3單線態氧加入甲醇最多能保存多久?

    具體時間不確定,因為空氣中有氧,無論是放甲醇中還是粉末,熒光強度都會一點點衰減,放-80低溫衰減的會緩慢一點。

    4能檢測細胞里的單線態氧么?

    不可以的,一般細胞檢測活性氧用DCFH-DA探針較多。

    5被檢水溶液怎么制備?

    用甲醇配成濃度約5mM的儲液,即向每管100μg包裝的小瓶里加入33μL甲醇。使用前立即準備本試劑的工作溶液,并在實驗結束后丟棄任何多余的稀釋試劑。SOSG單線態氧熒光探針適用于水環境,最佳稀釋緩沖液和工作濃度應由經驗確定,一般建議起始濃度范圍是1~10μM。

    外泌體試劑盒常見問題

    1)提取方法,適用范圍

    我們外泌體試劑盒MA0403采用沉淀法,沉淀法適合WB檢測,RT-PCR

    2一次實驗需要多少體積血清/血漿?

    至少0.5 ml血清/血漿樣本。更少的血清體積雖也可以提出外泌體,但產量可能較低,不滿足后續實 驗需求。

    3本品提取的外泌體如何應用于下游實驗?

    可直接使用下一步實驗的試劑處理離心后的沉淀。例如,可直接加入合適裂解液后,用移液器 吹打或使用勻漿器重懸沉淀后進入RNA和蛋白提取流程。如需重懸,可用適量1 × PBS重懸離 心后的沉淀。

    4血清/血漿外泌體沉淀如何重懸?

    血清提取的外泌體沉淀可使用適量1 × PBS或其他下游實驗所需試劑進行重懸。沉淀重懸有時 會較為困難,若后續實驗對外泌體的完整性無要求,可使用低速勻漿器進行重懸。

    5)細胞提取外泌體的注意事項

    1). 美侖公司MA0402適用于各種類型細胞培養液上清中外泌體的提取。為防止 FBS 中較多的牛外泌體造成污染,可在 細胞培養至 50%-70%左右更換無血清培養基或者不含外泌體的血清培養基,繼續培養約 12~48h 后收集 上清使用。也可直接使用不含外泌體的血清培養基直接培養細胞,后續直接收集細胞培養液上清進行外泌 體提取。

    2). 一次實驗需要多少體積細胞培養液取決于上清中外泌體的量,可能受細胞類型、狀態、數目的影響各不 相同,根據實驗需求決定樣本起始量。

    3). 用固定角度的離心機離心時,需標記管子的擺放方向。一般樣本中外泌體含量較少,離心后可能肉眼觀 察不到沉淀,標記方向后,在重懸時將 1×PBS 朝離心管靠外側的內壁反復吹打洗脫即可。

    4). 離心后的沉淀可用 100-200 μL 的 1×PBS 重懸后使用,也可使用下一步實驗的試劑直接處理沉淀。 例如,可直接使用裂解液吹打重懸沉淀后進入 RNA、蛋白質提取流程。

    細胞核染料DAPI、Hoechest33258、Hoechest33342區別

    DAPI是可以通過完整細胞膜的,可以染活細胞也可以染死細胞,但是因為DAPI是半透性的,染活細胞的效果沒有染死細胞好。所以DAPI一般用來染固定后的細胞;Hoechst透膜性比DAPI好,染活細胞更常用, Hoechst33258容易透過細胞膜,而Hoechst33342多用于細胞凋亡檢測,還可以PI和Hoechst33342雙染做流式;另外,Hoechst33342的細胞毒性比Hoechst33258要小。

    有些綠色熒光的染料,用紅光熒光的濾光片也能看到紅色,是怎么回事呢?

    市面上現在染料有的存在竄色現象,濃度稍大產生了聚合物沉淀,而改變了發射波長,建議:可以試下降低染色濃度,調整一下反應條件,這種情況會改善的。

    細胞污染,真菌,細菌和黑膠蟲,支原體對應處理試劑

    細菌:青霉素(25-100ug/ml)鏈霉素(25-100ug/ml) 、慶大霉素(10-100ug/ml)

    真菌:MB1014兩性霉素B

    支原體:MA0340支原體清除試劑;MA0339支原體預防試劑;MA0144支原體檢測試劑盒

    黑膠蟲:一般為血清原因,建議勤換液,PBS清洗,換瓶

    溶酶體染料:溶酶體紅色熒光探針(LysoTracker Red DND-99)(MB6041)/ 溶酶體綠色熒光探針(LysoTracker Green DND-26)(MB6042)/溶酶體綠色熒光探針(LysoSensor Green DND-189)(MB6043)

    熒光顏色不同、波長不同:MB6041為紅色熒光(577nm,590nm),MB6042(504nm,511nm)和MB6043(443nm,505nm)為綠色熒光。

    原理不同:MB6041該類探針是對活細胞酸性區式進行選擇性染色的熒光染料。具有幾大重要的特點,1)選擇性標記酸性細胞器;2)納摩爾級(nM)濃度即可有效標記活細胞;3)具有多色探針提供,可根據情況對樣品進行多標實驗。MB6042  LysoTracker結構上由一個熒光基團和相連的弱堿基構成,可自由穿過細胞膜,一般聚集在球形細胞器上,適用于觀察溶酶體內部生物合成及相關發病機理。Lysotracker中性pH下僅僅發生部分質子化,因此該探針標記細胞器的原理可能與其完全質子化并滯留在細胞器膜上有關。MB6043 LysoSensor系列探針是主要對活細胞中的酸性區室(如溶酶體、頂體精子)動態合成和功能進行研究的一類熒光探針,該類探針的染色具有向酸性,可通過質子化作用在酸性細胞器內累積。該類探針的這種質子化作用還可解除染料的熒光淬滅性,使其所發射的熒光強度更強。因此,與LysoTracker系列探針相比,LysoSensor系列探針隨著細胞器的酸化程度其熒光強度呈pH依賴型(向酸)增強。

    需注意:MB6042溶酶體綠色熒光探針(LysoTracker Green DND-26) 染色后可以固定,且其維持時間長,要是做示蹤的話更適合;MB6043溶酶體綠色熒光探針(LysoSensor Green DND-189) 不可固定,其依賴低pH,所以染色后固定會嚴重影響pH從而嚴重影響發光。同時也因為MB6043隨著細胞器的酸化程度其熒光強度呈pH依賴型(向酸)增強,故此能看到顏色變化。

    線粒體熒光探針試劑盒:線粒體紅色熒光探針(MitoTracker Red CMXRos)(MB6046)/ 線粒體綠色熒光探針(MitoTracker Green FM)(MB6044)

    MB6046/MB6044均為線粒體熒光探針,MB6044為綠色熒光(490nm,516nm),MB6046為紅色熒光(579nm,599nm),兩者均可染活細胞(不能染組織)。與MB6046不同的是,MB6044定位線粒體的能力不受線粒體膜電位的影響,但MB6044不適合于醛類固定,會使熒光信號丟失,因此更適合活細胞染色。而MB6046染色后可根究實驗需求進行固定(醛類)和透化(Triton-100),探針依然維持在細胞內,且更適合雙標實驗。

    Fura-2/Fluo-3/Fluo-4區別?

    1、Fura-2 AM的熒光比較弱,最大激發波長為369 nm,最大發射波長為478 nm,并且其熒光不會隨鈣離子濃度改變而改變;Fura-2 AM進入細胞后可以被細胞內的酯酶剪切形成Fura-2,從而被滯留在細胞內。Fura-2和鈣離子結合后,最大激發波長為335 nm (最大激發波長隨離子濃度的不同而有所不同),最大發射波長為505 nm。

    2、Fluo-3 AM進入細胞后可以被細胞內的酯酶剪切形成Fluo-3,從而被滯留在細胞內。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的,其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。Fluo-3可以和鈣離子結合,結合鈣離子后可以產生較強的熒光,最大激發波長為506 nm,最大發射波長為526 nm。實際檢測時推薦使用的激發波長為488 nm左右,發射波長為525-530 nm。

    3、Fluo-4 AM是最常用的檢測細胞內鈣離子濃度的熒光探針之一。Fluo-4 AM將Fluo-3 AM結構中的氯原子替換成了氟原子,導致它的最大激發波長會向短波長處偏離10 nm左右。這個波長更接近于氬激光器的波長488 nm,所以用氬激光器激發時,Fluo-4的熒光強度會比Fluo-3強一倍,Fluo-4可以和鈣離子結合,結合鈣離子后可以產生較強的熒光,最大激發波長為494 nm,最大發射波長為516 nm。Fluo-4 AM(鈣離子熒光探針) 是配制于無水DMSO (anhydrous DMSO)中的儲存母液,濃度為2mM。

    細胞凋亡常見問題

    1Annexin V/PI試劑盒為什么用不含EDTA胰酶?

    Annexin V 是 Ca 依賴性蛋白, 所以不能加入 EDTA, 防止 EDTA 螯合了 Ca 離子從而影響 Annexin V, 進而影響結果。

    2Annexin V/PI試劑盒做單染用普通細胞還是凋亡細胞?單染一定要做么?

    單染一定要做,需要畫十字門調補償單染可以用正常細胞做,但是正常細胞凋亡有的比較少,畫門可能不是很清晰;建議設置經凋亡誘導的正常細胞、PI 單染和 Annexin V-FITC 單染 3 個對照組,正常細胞組可作為熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置。結果可用 CellQuest等軟件進行分析,繪制雙色散點圖(two-color dot plot),FITC 為橫坐標,PI 為縱坐標。

    3凋亡試劑盒Annexin V不受GFP等干擾?

    美侖凋亡試劑盒有三款,Annexin V-FITC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒;AnnexinV-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(50T);其中貨號MA0220,AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒,FITC發綠色熒光,PI發紅色熒光;貨號 MA0428 AnnexinV-FITC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒中,將PI更換為了 7-AAD,也發紅色熒光,但其發射光譜較PI窄,且發射波長更長,對其他檢測通道的干擾更??;貨號MA0429 AnnexinV-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒,選擇PE(MB5943藻紅蛋白)與Annexin V 偶聯,其中PE 的激發波長為為495,545或565nm ,發射波長575nm,發出紅色熒光,在多色熒光分析中,在待檢測的細胞已經表達GFP等綠色熒光蛋白的情況下,推薦客戶選購Annexin V PE/7-AAD試劑盒。

    4Annexin V-FITC/PI可以做貼壁細胞原位熒光檢測嗎?

    美侖Annexin V-FITC/PI可以做原位熒光檢測,注意:一定要用試劑盒里的buffer;染料加量適當提高。

    5)單純檢測磷脂酰絲氨酸暴露的情況,不需要染核,可以用Annexin V/PIMA0220)試劑盒么?

    可以用的,不染核的話,不用PI就行了

    (6) 細胞活力(活死細胞染色)檢測試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒有什么區別?

    細胞活力(活死細胞染色)檢測試劑盒(MA0361)是區別活細胞總數和死細胞總數;死細胞包括:壞死,死亡,凋亡; 細胞凋亡檢測試劑盒(MA0220)可以區別出活細胞,早期凋亡細胞,晚期凋亡細胞,壞死細胞

    7TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒適用于組織切片嗎?

    可以用于組織切片,如果是新鮮組織,需要固定液固定,做成切片

    8Tunel實驗,加抗熒光衰減封片劑之后怎么保存呢?能保存多久?

    常溫;避光放就行;保存時間具體得看熒光,但是熒光總會衰減;一般兩三天沒問題。

    9Tunel怎么計算凋亡指數?

    在共聚焦下,凋亡率(凋亡指數)的計算方法如下:每個樣品隨機計數4個視野,按公式計算 凋亡指數(AI):AI=凋亡細胞數/(凋亡細胞數十正常細胞數)。統計學方法 結果采用x土s表示,多組樣本均數用單因素方差分析,組間兩兩比較用Scheffe檢驗,兩樣本均數的比較用t檢驗.

    10)臺盼藍/活死細胞染色試劑盒區別

    活死細胞染色試劑盒:Calcein AM是一種可對活細胞進行熒光標記的優良染色試劑,其能夠輕易穿透活細胞膜。胞內的酯酶會將其水解為Calcein(鈣黃綠素)留在胞內,發出強綠色熒光;而碘化丙啶(PI)不能穿過活細胞的細胞膜,但其能穿過死細胞膜的無序區域而到達細胞核,并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產生紅色熒光(激發:535 nm,發射:617nm),從而對死細胞染色。是基于鈣黃素AM和碘化丙啶(PI)的活死細胞染色試劑盒,可用于動物細胞樣品的活力和毒性檢測。而臺盼藍是細胞活性染料,常用于檢測細胞膜的完整性,還常用于檢測細胞是否存活?;罴毎粫蝗境伤{色,而死細胞會被染成藍色。

    11)細胞周期試劑盒(MA0334)細胞染色時間到了,但是來不及上流式怎么辦?

    可以先固定,加入 1ml PBS 充分重懸,成單細胞,輕輕邊渦旋邊緩慢滴加 3ml 預冷的無水乙醇,至 終濃度 75%,4℃固定 4h 以上,或者 4℃靜置過夜(18-24h)效果更佳。固定后的細胞 可以-20℃保存一個月,之后檢測時離心即可。

    細胞增殖常見問題

    1CCK-8對于不同的細胞,靈敏度是否一樣?

    不一樣,懸浮細胞與貼壁細胞相比較難顯色。對于貼壁細胞,一般加入CCK-8培養0.5-4小時吸光度已經很高,但對于懸浮細胞則可能吸光度較低,可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數量來解決。

    2)哪些物質會影響CCK-8的測定?

    當有氧化還原性物質存在時會影響CCK-8的測定,因此當所加藥物為氧化還原性物質時需要換液再進行檢測。

    3CCK-8試劑盒如何設定空白對照?

    在不含細胞的培養基中加入CCK-8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時,還應考慮藥物的吸收,可在不含細胞,加入藥物的培養基中加入CCK-8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度作為空白對照。

    4CCK-8試劑盒鋪板細胞量有什么要求嗎?

    96孔板細胞計數的時候一般是104,我們鋪96孔板,細胞濃度是5*104,取100ul鋪板;可以您自己對細胞計數,保證每孔細胞數量一致?;蛘呖梢杂嫈?,方法:按不同細胞數鋪板,貼壁后加cck,孵育1小時,然后檢測,OD值在1.5左右是最佳鋪板數

    5CCK-8試劑盒反映時間怎么確定?數值必須是1么?

    0.1-2.5都可以,最佳是1.0左右

    6CCK-8試劑盒細胞能一邊培養一邊檢測?

    培養一段時間測CCK-8,然后換液后可以接著養。

    7)做CCK-8經常有氣泡,對吸光度有影響,有什么辦法去除么?

    有氣泡,沒辦法去除,但是可以避免有氣泡,加藥時槍頭抵著孔壁,慢點加液體,基本不會產生氣泡,如有條件可將96孔板離心,這樣氣泡就會消失

    8CCK-8試劑盒OD值偏高?

    可以確認下培養時間,一般肉眼可見顏色變化即可檢測

    9CCK-8除了用酶標儀還可以用什么儀器?紫外分光光度計行么?

    一般CCK-8都是用酶標儀,紫外分光光度計最好不用,因為紫外我沒記錯一次只能測一個孔吧,而且還得把孔內液體吸出來到紫外用的皿里,而且檢測時間很長,CCK-8對孵育時間敏感,這樣誤差太大了

    10CCK-8會導致細胞死亡嗎?

    CCK-8本身對細胞毒性特別小,作用時間長不會導致細胞都死亡,但是細胞長滿了,本身代謝會引起細胞死亡

    11CCK-8試劑盒每次測定的數值不一樣,是什么原因?如何解決?

    可能會有以下幾個原因:

    1)當在培養箱內培養時,培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發,由于體積不準確而增加誤差。一般情況下,最外一圈的孔只加培養基,不作為測定孔用。

    2)有可能會因為CCK-8沾在壁上而產生誤差,建議在加入CCK-8后,輕輕敲擊培養板以幫助混勻。

    3)每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1,000~100,000個/孔范圍內摸索條件。

    4) 重復試驗請保證孵育時間、接種細胞數相同。

    (12)CCK-8試劑盒和EDU試劑盒區別:

    如檢測單個藥的毒性推薦EDU,EDU檢測增殖最準確的方法,因為他是檢測DNA合成情況的,cck因為伴隨代謝,有些藥物影響到代謝,所以有時候最后測得的抑制率并不一定是和細胞毒性成正比的;但是DNA變化是準確的,而且可以用于流式     

    如前藥物篩選化合物多的話建議用CCK-8,因為edu操作步驟比較復雜,不適合前期藥物篩選,cck反映速度快,操作簡單,適合前期實驗

    13EDU細胞孵育時間怎么確定?

    時間可以去ATCC上看下細胞倍增時間,通常宜繼續孵育細胞周期10%左右的時間。

    143%BSA作用是什么?

    3%BSA作用封閉穩定熒光

    15EDU試劑盒做流式怎么收集細胞呢?固定的細胞都是碎片了?

    孵育完edu之后收集細胞,然后在固定,之后按照懸浮細胞往后做,每步均需要離心3200rpm/5min

    16) EdU染色之后,先用熒光顯微鏡測一下,再進行細胞核復染,再測一次呢,還是胞核染好了一起測就行?

    都可以,可以染完edu,先用顯微鏡看下,然后在核復染,再看下;也可以染完edu,直接染核,然后在不同波長刺激下看。

    17)染完了要立即用熒光顯微鏡觀察嗎,可以放多久?

    最好立即看,因為熒光有猝滅,如果想保存一段時間可以加封片劑,但是也建議先看一下在加封片劑,在觀察,因為加封片劑熒光也是有所衰減的,肯定沒有剛染完的好

    18)洗滌液通透液怎么配?

    洗滌液是3gBSA加100ml的PBS;通透液TritonX是液體,也就是0.4ml到100mlPBS,配完放4度就行。

    WB常見問題

    (1) 內參過爆

    大連美侖ECL是飛克級的,靈敏度比較高,內參蛋白的話,建議使用的時候減少ECL用量,如果能調節時間的話,盡量時間短一些,如果手動曝光的話就1-2s就可以,一抗洗膜時間和洗膜次數可以適當延長

    2)曝光磷酸化蛋白比較模糊

    可能原因:

    1)因為磷酸化蛋白本身含量就少,特異性在不好,很容易出現這樣的條帶,抗體一定要買好一點的

    2)目的蛋白如果較大,轉膜時間要延長,適當調整轉膜時間

    3)適當調高一抗二抗稀釋倍數

    4)磷酸化封閉用tris體系的BSA,封閉時間可以長一點。

    3)預制膠兩邊marker有些傾斜或者不在同一條線上

    預制膠存在邊緣效應,樣本允許的條件下可以把兩邊空出來,或者上一些廢樣做保護

    4)樣本-20℃放了一年了,還能用么?效果會不會有影響?

    組織久了,效果會有點影響,但是不好說影響大不大,WB也是需要看具體蛋白情況,有些蛋白可能就是不好跑,您可以先做下預實驗,挑選幾個樣本,跑個內參,看下蛋白彌散不?如果彌散了其他目的蛋白肯定也不好了,如果不彌散,還可以的話可以做下目的蛋白,但這個檢測只能說明樣本還能跑蛋白,但是不保證每個目的蛋白都一定能跑好

    5loading buffer 加沒加蛋白酶抑制劑?

    美侖的loading buffer 沒加蛋白酶抑制劑,蛋白酶抑制劑是在蛋白提取的時候加的,這只是一個上樣的緩沖液;緩沖液在沒有稀釋前,有高濃度的變性劑,蛋白酶是無法存在的

    6)蛋白印記膜再生液能否重復用?

    試劑pH很重要,重復用會使pH升高,效果減弱,建議不要重復使用

    7)預制膠需要壓樣么?可以直接跑嗎?

    美侖預制膠不用壓樣,直接跑就可以,電泳條件:150 V,30-40 min,當溴酚藍指示帶電泳至凝膠底部,或實驗預定位置時,即可結束電泳。如果想得到更加清晰平直的條帶,可降低電壓至 100-120V,并適當延長電泳時間。當然壓樣也可以,條帶可能會更加好看。

    8sds-page用預制膠跑完不在一條線上?

    可能原因:樣品的蛋白濃度或者離子影響了遷移速度,上樣量一樣,但是蛋白濃度不一樣,那么蛋白量就不一樣,蛋白的量相對越多,跑的越慢,但是做蛋白表達不影響結果的;或者也可以:如果蛋白濃度差的多建議調整濃度,可以讓蛋白量一致(比如都是20ug,根據蛋白濃度),調上樣量,差的多的可以用上樣緩沖液補.

    9sds-page用預制膠跑完條帶有點彎曲?

    電泳的時候保證內槽液體不漏液,降低電泳電壓,濃縮膠60V,分離膠80V,,如果方便可以放些冰塊降溫,上樣前,樣品重新煮一下,冷卻離心,取上清

    10sds-page用預制膠跑條帶出現笑臉。

    可能原因:電壓高,遷移快,兩邊比中間慢,其實正常,想要改善可以調電壓到80V。

    11sds-page用預制膠跑條帶出現哭臉

    可能原因:蛋白堵塞,樣本可能是有雜質堵住了膠孔,改善制樣過程。

    12)預制膠電泳槽內槽加滿電泳液后,如看到個別膠孔里有絮狀物

    用注射器或其他工具吸取電泳液輕輕吹打加樣孔,以去除加樣孔內殘留的儲存緩沖液和雜質,后在正常上樣。

    13)預制膠跑膠過程出現黃化

    麻煩核對一下電泳緩沖液,美侖預制膠HEPS體系,不可使用tris-甘氨酸體系緩沖液,1X 變性凝膠電泳液參考配方為:100 mMTris, 100 mM HEPES, 0.1% SDS, 2 mM EDTA。

    14)預制膠適用于哪些儀器?

    美侖預制膠兼容性強,兼容目前市場各種mini電泳槽, 包括:Bio-Rad Mini-PROTEAN (II/3 /Tetra System);Hoefer Mighty Small (SE250/SE260/SE280);Life Technology Novex Mini-Cell (請與免費提供的特制擋板配合使用);北京六一 DYCZ-25E、DYCZ-24DN、DYCZ-24K、DYCZ-24KS、DYCZ-24KF;君意東方 JY-SCZ2+;天能 VE180;以及其它膠板寬度在10cm的電泳槽。如是伯樂款儀器可以參考說明書中膠條反裝,或者購買伯樂款專用

    15)裂解蛋白,呈果凍狀,還有點膠狀呢?

    離心時間過長,基因組出來了,正常離心后,取上清就可以,DNA會在沉淀里面,12000rpm,或者重提的話裂解時間縮短一些。

    16)麗春紅染膜效果不好?

    可能原因

    1)膜上蛋白太少了,麗春紅識別率是要低于曝光的,可以正常曝光看下結果。

    2)如果染膜之前用牛奶封閉過,封閉的蛋白染膜是不會在膜上的

    部分產品單位寫的g,收到產品是液體?

    部分產品由于本身熔點,自身性質,就是液體狀態,例如肉桂醛,常溫就是液體。

    粉末狀產品明明看到母液已經完全溶解了,稀釋之后又有析出?

    因為粉末在液體中有一定的溶解度,尤其有的粉末用有機試劑溶解后需要用PBS,水稀釋,而產品本身不溶于水,這時候稀釋就會有析出,可以母液配置完成后超聲一下,稀釋之后再超聲水浴一下,這樣基本可以溶解;如析出的結晶依然存在,那就是溶解度達不到,需要調整下溶解度。

    有些產品只能用DMSO溶解,給動物DMSO還需要小于5%,怎么辦?

    (1)超聲水浴加速溶解

    (2)如果是灌胃方式給動物可以混懸液

    (3)可以選一些助溶劑例如PEG300,吐溫80等。

    收到化合物顏色/包裝/溶解度和之前不一樣?

    同一產品不同批次之間存在差異,這是正?,F象,麻煩以收到本次產品的COA為主。

    收到產品感覺包裝品是空的?

    如果您購買的產品的量非常小,同時有些產品在凍干的過程中粘附在管壁上形成薄薄的一層,可能觀察不到產品的存在。您可以加入指定溶劑(參照操作手冊)并渦旋或超聲震蕩使之完全溶解。

    對于蠟狀或油狀的產品很難取出稱量它們的質量,我們建議您用合適的溶劑直接溶解該化合物;對于具有吸濕性的化合物,暴露在空氣中會吸收水分,呈現液滴狀,這種產品需要放置在干燥器中保存。

    化合物等產品寫非無菌包裝,用于細胞怎么處理?

    滅菌方式,我們建議通過0.22μm微膜過濾方式除菌,請勿采用紫外,射線或者高溫滅菌方式,否則會影響化合物活性,甚至破壞其結構導致徹底失活。

    產品到了冰化了影響使用么?

    對于需要低溫儲存的產品,我們在運輸時候都會采用冷藏包裝,但是部分由于外界氣溫過高,運輸時間較長,對于普通冷藏包裝,途中可能會溫度升高,這些都是沒有問題的,因為這種普通冷藏只適用于那些短期內(2周)高溫依然穩定的產品,建議低溫的儲存條件,只是長期儲存時候的條件,您可以放心使用。對于某些特殊的產品,如抗體,我們會采用干冰冷藏包裝,確保全程低溫。美侖公司都對產品性狀進行了嚴格的穩定測試,行業經驗豐富。

    產品怎么是ug/mg,不是百分之多少?

    麻煩收到產品以COA內容為準,不是所有產品都是液相檢測方法,有些產品是效價檢測的,我們檢測方法一般是按照藥典檢測的。

    原料藥鈉鹽和鉀鹽形式

    有些化合物鈉鹽鉀鹽形式和原料藥之間,藥效基團是一樣的,只不過物理性質有所改變,鹽形式溶解性會好一點。

    原料藥和標準品的區別

    主要是用途的不同。
    原料藥:主要是用于做成制劑,實驗室可用于動物體內或體外試驗(細胞試驗)。
    標準品(對照品):是一個參照物,一般都是用來含量測定用的,因為是一個參照物,其更側重含量的準確性??梢岳斫鉃闇蚀_標定過的原料藥,所以也可以用于動物體內或體外試驗(細胞試驗)。

    關于產品分裝及溶液配制

    產品分裝:您收到貨物后最好不要自己進行分包,因為分包環境、包裝材料等因素可能導致分包后的產品變質;如您有特殊包裝要求,請在訂購時候與我們客服代表闡明,當然價格會做適當調整。對于開蓋后,長期未使用的,請務必重新密封好,建議Parafilm封口膜,并按照相應儲存條件使用。如果放置時間過長,超過產品有效期,建議您重新購買,以免影響實驗質量。

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